Logo

Секвенирование ДНК

Секвенирование ДНК – это технология «прочтения» ге­не­ти­чес­ко­го кода [1]. Что такое ДНК, вы можете узнать в нашей предыдущей статье. А данный материал является переводом статьи, опу­бли­ко­ван­ной в 2016 году в целом ряде ве­ри­фи­ци­руе­мых научных журналов [1], [2]. Так же статья будет дополнена свежими данными за 2018 год [3] и немного упрощена в технической части. Актуальность статьи обусловлена невероятной скоростью развития данной технологии [4]. Ввиду этого, полезно знать не только историю развития се­кве­ни­ро­ва­ния ДНК, но и существующее положение дел. Тем не менее, поскольку данная статья является переводом, каких-то других ссылок не будет, а работы, на которые ссылаются сами ис­сле­до­ва­те­ли, можно посмотреть в оригинале.

ПРОЧЕСТЬ ГЕНОМ

Определение порядка остатков нуклеиновых кислот в био­ло­ги­чес­ких образцах является важной частью широкого круга исследований. За последние пятьдесят лет множество ис­сле­до­ва­те­лей занимались разработкой технологий и методологии для решения задачи се­кве­ни­ро­ва­ния молекул ДНК и РНК. Мы стали свидетелями грандиозных открытий! Сначала мы научились се­кве­ни­ро­ва­нию коротких оли­го­ну­клео­ти­дов, а затем цепочек с миллионами нуклеотидных оснований. От попыток се­кве­ни­ро­ва­ния одного гена мы дошли до се­кве­ни­ро­ва­ния ДНК. В данной статье мы проследим этот путь, осветив и без того яркие события истинного познания себя.

«Знания о секвенировании могут нам помочь познать суть живой материи» Фредерик Сенгер. Порядок нуклеиновых кислот в по­ли­ну­клео­тид­ных цепочках, в конечном счёте, содержит информацию о на­след­ст­вен­ных и био­хи­ми­че­ских свойствах земной жизни. Именно поэтому способность измерять или синтезировать такие по­сле­до­ва­тель­но­сти, совершенно необходима для био­ло­ги­че­ских ис­сле­до­ва­ний. Эта статья посвящена тому, как исследователи на протяжении многих лет изучали проблему разгадки ге­не­ти­чес­ко­го кода. Для удобства данная статья разбита на главы, выделяющие вехи в се­кве­ни­ро­ва­нии ДНК. Итак, поехали!

Первые шаги

Уотсон и Крик установили трёхмерную структуру ДНК в 1953 году (прим. редакции Кольцов писал об этом ещё в 1928 году [5]), используя данные Розалинды Франклин и Мориса Уилкинса. Это стало основой работ, как по репликации ДНК, так и по изучению кодирования белков в нуклеиновых кислотах. Однако, способность «читать» ДНК долго всё ещё оставалась лишь отдалённой перспективой. Способы, разработанные для определения по­сле­до­ва­тель­нос­ти белковых цепей, не удавалось применять для исследования нуклеиновой кислоты. Молекулы ДНК намного длиннее и их структура гораздо более однородна, ввиду чего их сложно определить. Необходимо было разработать новую технологию.

ХИМИЯ ДНК

Сначала усилия сосредоточили на секвенировании наиболее простых РНК. Таких, как рибосомная РНК микробов, транспортная РНК (тРНК) и геномы одноцепочечных РНК-бактериофагов. Их достаточно просто выделить, и они не осложнены ком­пле­мен­тар­ной цепью, ввиду чего значительно короче ДНК. Кроме того, ферменты рибонуклеазы (РНКазы), способные «вырезать» цепочки РНК на определенных участках цепи, были к тому времени известны. Но поскольку доступные методы позволяли измерять только состав нуклеотидов, в то время как их порядок оставался загадкой, процесс изучения был «долог и тернист».

СТРУКТУРА ДНК

Прорыв случился, когда методы аналитической химии объединили с методами селективной обработки РНКазы, учтя особенности нуклеотидного основания РНК. Произошло это в 1965 году, когда Роберт Холли со своей ис­сле­до­ва­тельс­кой группой «прочли» по­сле­до­ва­тель­ность тРНК Saccharomyces cerevisiae. Они использовали метод се­кве­ни­ро­ва­ния Фредерика Сенгера. Он основан на обнаружении фрагментов частичного расщепления, помеченных радиоактивным изотопом. Используя этот же метод, в 1972 году в лаборатории Уолтера Фирса смогли разобрать первую полную по­сле­до­ва­тель­ность кодирующего белок гена бактериофага MS2. Четыре года спустя удалось осуществить се­кве­ни­ро­ва­ние его полного генома.

Секвенирование ДНК: первое поколение

Вот тогда и началась настоящая история се­кве­ни­ро­ва­ния ДНК. По­спо­соб­ст­во­вал этому разработанный метод ректификации генома бактериофагов. Рэй Ву и Дейл Кайзер использовали наблюдение ко­м­пле­мен­тар­нос­ти нуклеотидных оснований. Они взяли ДНК-полимеразу, помечая концы ра­дио­ак­тив­ны­ми нуклеотидами. Затем подобрали ком­пле­мен­тар­ные нуклеотиды для выведения по­сле­до­ва­тель­нос­ти. Всё это происходит незадолго до того, как этот метод будет доработан, и исследователи получат возможность определять порядок нуклеотидов на любом участке цепи. Тем не менее, определение оснований всё ещё ог­ра­ни­чи­ва­лось короткими отрезками ДНК, а протокол исследований включал большое количество методов ана­ли­ти­че­ской химии и процедур фрак­цио­ни­ро­ва­ния.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ

Следующим шагом было замещение двухмерного фрак­цио­ни­ро­ва­ния на электрофорез в по­ли­ак­ри­ла­мид­ном геле. Этот способ в 1970 использовался в методе «плюс/минус» Алана Коулсона и Фредерика Сенгера, а так же в 1975 в методе химического расщепления Алана Максама и Вальтера Гилберта. Следует заметить, что, не смотря на использование в обоих случаях по­ли­ак­ри­ла­мид­но­го геля, методы различаются. Но они оба являются прародителями настоящей техники се­кве­ни­ро­ва­ния ДНК. Тем не менее, из-за своей простоты именно метод Сенгера стал ведущим и до сих пор является эталоном надёжности. Хотя его и используют относительно редко, поскольку он очень дорогой.

Методы конкуренты

В методе «плюс/минус» использовалось радиоактивное мечение и «испорченные буквы», в которых нет места для новых связей. Таким образом, в каждую пробирку клался определённый набор букв, а в итоге получались цепочки разной длины, на одном конце которой была радиоактивная метка, а на другом «испорченная буква», к которой ничего не могло присоединиться. Далее всё это «разгонялось» в геле, а затем рас­кла­ды­ва­лось на фотоплёнку, и ДНК собирался путём синтеза данных. Синтез возможен потому, что мы знаем, в какую пробирку какие буквы мы клали. Всё, что остаётся сделать исследователям, это подняться по «лестнице» и «прочесть» всю по­сле­до­ва­тель­ность ДНК.

СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК

Метод секвенирования ДНК Максама–Гилберта предполагает разделение по­ли­нук­лео­тид­ной цепи на фрагменты с помощью химического расщепления. Расщепления осу­щест­вля­ет­ся по определённым основаниям нуклеотидов, поэтому после «разгонки» в геле и определения длины фрагментов, можно определить положение меченых нуклеотидов. И в итоге собрать по­сле­до­ва­тель­ность ДНК. Тем не менее, первое полное сек­ве­ни­ро­ва­ние ДНК бактериофага φX174 удалось осуществить именно Сенгеру. (прим. редакции а в 1980 году Гилберт и Сенгер получили Нобелевскую премию [6]). И, как мы уже отмечали выше, именно метод Сенгера сыграл решающую роль в развитии технологии секвенирования ДНК.

Автоматизация

Метод Сенгера был в дальнейшем доработан. Во-первых, ра­дио­ак­тив­ную метку заменили на флуо­рес­цент­ную, во-вторых, внедрили методологию капиллярного электрофореза. Всё это позволило ав­то­ма­ти­зи­ро­вать процесс, внедрив технические устройства для сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК. Но машины для сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК первого поколения не позволяли анализировать длинные фрагменты генома, поэтому был разработан «метод дробовика». Этот метод предполагал клонирование фрагментов ДНК, которые потом собирались в силиконе в одну длинную непрерывную по­сле­до­ва­тель­ность. Затем всё это «вылилось» в дидезокси-метод секвенирования с ис­поль­зо­ва­ни­ем таких устройств, как ABI PRISM, разработанных Лероем Худом.

Второе поколение ДНК секвенаторов

Наряду с дидезокси-секвенированием развивалось так же пи­ро­сек­ве­ни­ро­ва­ние ДНК. Оно получило такое название в результате использования пирофосфата для определения по­сле­до­ва­тель­нос­ти ДНК. Суть принципа заключается в использовании АТФ-сульфатазы для прихождения пирофосфата в аде­но­зин­три­фос­фор­ную кислоту (АТФ), которая используется в качестве субстрата люциферазы. В результате происходит вспышка света, мощность которой пропорциональна количеству пирофосфата. У этого метода есть преимущество. Он позволяет использовать натуральные нуклеотиды и наблюдать результат в реальном времени. Тем не менее, есть и трудности. Яркость вспышки позволяет определить длину гомополимера, но точность определения нуклеотидов оставляет желать лучшего.

Пиросеквенирование

Патент на пиросеквенирование получила компания 454 Life Sciences, в результате чего она стала первой успешной коммерческой компанией сек­ве­ни­ро­ва­ния нового поколения (СНП). Главной особенностью данной технологии сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК является быстрота и дешевизна. Она позволяет обрабатывать огромные объёмы данных. ДНК фраг­мен­ти­ру­ет­ся на кусочки по 300–500 пар оснований, затем, при помощи оли­го­нук­лео­ти­да, цепи прилипают к пластиковым бусинам. Причём к каждой бусине прилипает лишь одна цепочка!

ДНК ЦЕПОЧКА

Бусина затем попадает в капельку масла, содержащую смесь для реализации полимеразной цепной реакции (ПЦР), происходящей в каждой отдельной капельке эмульсии (эПЦР). В результате происходит амплификация ДНК, то есть, клонирование, после чего эмульсия разрушается, а вновь созданные в ходе ПЦР двуцепочечные фрагменты ДНК разделяются, и бусины, несущие одноцепочечные копии ДНК-матрицы, помещаются в лунки «предметного стекла». Каждая лунка такого слайда образует отдельный пиколитровый «реактор», в котором и будет происходить реакция секвенирования.

ВОЗМОЖНОСТИ СЕКВЕНИРОВАНИЯ

Эта установка способна производить считывание около 400–500 пар оснований для миллионов или около того скважин, которые, как ожидается, будут содержать подходящие клонированные бусины. Эта параллелизация и привела к росту про­из­во­ди­тель­нос­ти технологии. Например, исследователи смогли с её помощью намного быстрее «прочитать» геном пионера секвенирования ДНК Джеймса Уотсона, чем при использовании секвенсора Sanger командой Крейга Вентера. И именно эта высокая скорость обработки данных сделала технологию доступной для широкого потребителя. Причём новая машина 454 GS FLX ещё более эффективна, чем их старая модель GS 20.

Секвенирование Solexa

Параллельно создаются другие методы сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК, наиболее заметным из которых является Solexa, приобретённый Illumina. Суть метода заключается в следующем. К обоим концам предварительно фраг­мен­ти­ро­ван­ной ДНК лигируют адаптеры, необходимые для ПЦР и последующего секвенирования на молекулярных кластерах. Полученные ДНК-библиотеки иммобилизуют на поверхности проточной ячейки, где и проводят циклический процесс сек­ве­ни­ро­ва­ния. Реакционная смесь для синтеза ком­пле­мен­тар­ной ДНК подается на поверхность проточной ячейки и содержит ферменты, оли­го­ну­клео­ти­ды, а также четыре типа флуоресцентно меченых дез­ок­си­нук­лео­зид­три­фос­фа­тов. После включения в синтезируемую цепь ДНК нуклеотида-терминатора, тип включенного нуклеотида и его положение идентифицируют с помощью ПЗС-матрицы. Затем терминирующая группа и флуо­рес­цент­ная краска отщепляются от нуклеотида, и цикл синтеза повторяется. Эта серия шагов продолжается определенное количество раз, число которых задает пользователь

Секвенирование SOLiD

Рынок секвенсоров очень динамичен, поэтому множество разных аппаратов было создано и кануло в Лету. Наиболее заметной альтернативой является SOLiD, которой сначала занималась компания Applied Biosystems, а потом Life Technologies. Данная технология сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК использует не синтез, а лигирование. Именно поэтому она не может достичь такой же длины и глубины «чтения» генетического кода, как Solexa, но из-за своей цены она остаётся конкурентно способной. Так же заметной технологией лигирования стали «ДНК наношарики» компании Complete Genomic.

Третье поколение секвенсоров

Существует немало споров о том, как отличать разные поколения секвенсоров, какие признаки следует учитывать и как их группировать. Особенно много трудностей вызывает отделение аппаратов третьего поколения от второго. Мы под третьим поколением понимаем те устройства, которые способны секвенировать отдельную молекулу. Все предыдущие поколения нуждались в амплификации. Секвенсоры третьего поколения нет. Первая такая технология была разработана лабораторией Stephen Quake. Их технология похожа на Solexa, но в ней используются обратимые флуо­рес­цент­ные нуклеотиды-терминаторы. Попытались использовать эту технологию в коммерческих целях Helicos BioSciences, но в 2012 году они подали документы на банкротство.

ЧТЕНИЕ КОДА ДНК

На 2016 год самой популярной технологией сек­ве­ни­ро­ва­ния ДНК третьего поколения была «Single molecule real time» или SMRT-секвенирование. Занимается данной технологией Pacific Biosciences. SMRT-сек­ве­ни­ро­ва­ние осу­щест­вля­ет­ся в специальных ячейках Zero-mode waveguide (ZMWs), которые, по сути, являются крошечными отверстиями в металлической плёнке, покрывающей подложку. В ячейку подаётся свет, но из-за строения ZMWs он не рассеивается, а освещает исключительно дно. Это позволяет подсветить молекулу, отмеченную флуоресцентным элементом, а поскольку зона освещения чрезвычайно точна, удаётся визуализировать одиночные молекулы даже на фоне соседних. Затем «детектируемый» элемент отщепляется и секвенирование продолжается для следующего положения нуклеотидной цепи.

ХРОМОСОМА

Особенностью SMRT-секвенирования является способность обнаруживать мо­ди­фи­ци­ро­ван­ные основания и секвенировать за раз очень длинные отрезки цепочки ДНК. Но наиболее перспективными секвенсорами третьего поколения являются GridION и MiniON, разрабатываемые компанией Oxford Nanopore Technologies. Так дела обстояли на 2016 год, и так же они обстоят на 2018. По факту карманный секвенсор MiniON в 2018 году позволил прочитать геном человека [3]. Точность секвенирования ДНК сравнили с результатами традиционных методов секвенирования, и оказалось, что точность MiniON стремится к 100%. Возможно, такие приборы в скором будущем появятся в каждой поликлинике!

P.S. Бла­го­да­рим за вни­ма­ние! На­де­ем­ся, что ста­тья бы­ла ин­те­рес­на и поз­на­ва­тель­на. Ес­ли у вас ос­та­лись ка­кие-ли­бо воп­ро­сы, есть за­ме­ча­ния или вы хо­ти­те выс­ка­зать сло­ва бла­го­дар­нос­ти, то для все­го это­го мож­но вос­­поль­­зо­­вать­­ся фор­мой ком­мен­та­ри­ев ни­же. Оце­ни­вай­те ста­тью, де­ли­тесь ею с друзь­я­ми в со­ци­аль­ных се­тях, до­бав­ляй­те сайт в из­бран­ное и бо­ри­тесь с мра­ко­бе­си­ем во всех его про­яв­ле­ни­ях, аминь!

Источники

[1] ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4727787/

[2] sciencedirect.com/science/article/pii/S0888754315300410

[3] nature.com/articles/nbt.4060

[4] genome.gov/sequencingcosts/

[5] elibrary.ru/item.asp?id=18445160

[6] nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1980/

[свернуть]
1 Звезда2 Звезды3 Звезды4 Звезды5 Звезд
Загрузка...

avatar
  Подпишись!  
Уведомлять
Вставить формулу как
Блок
Строка
Дополнительные настройки
Цвет формулы
Цвет текста
#333333
Используйте LaTeX для набора формулы
Предпросмотр
\({}\)
Формула не набрана
Вставить